If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Если вы используете веб-фильтр, пожалуйста, убедитесь, что домены *.kastatic.org и *.kasandbox.org разблокированы.

Основное содержание

Бактериальная трансформация и селекция

Трансформация плазмидной ДНК в бактерии. Селекция бактерии. Производство и очистка белка.

Основные моменты:

  • Бактерии могут поглощать чужеродную ДНК в процессе, называемом трансформацией.
  • Трансформация — ключевой этап в клонировании ДНК. Он происходит после обработки рестриктазой и последующего лигирования, в результате чего вновь образованная плазмида переносится в бактерии.
  • После трансформации бактерии отбираются в чашках с антибиотиком. Бактерии с плазмидой устойчивы к антибиотику, и каждая из них образует колонию.
  • Колонии с правильной плазмидой можно наращивать для создания больших культур идентичных бактерий, которые используются для производства плазмиды или белка.

Общая картина: клонирование ДНК

Трансформация и отбор бактерий — ключевые этапы клонирования ДНК. Клонирование ДНК — это процесс создания множества копий определенного фрагмента ДНК, например, гена. Эти копии часто создаются в клетках бактерий.
В классическом эксперименте по клонированию учёные сначала встраивают фрагмент ДНК, например, ген, в кольцевую молекулу ДНК, называемую плазмидой. Для этого этапа используются рестриктазы и ДНК-лигаза, а сам процесс вставки целевого гена называется лигированием.
Следующим шагом после лигирования является перенос ДНК в клетки бактерий - этот процесс называется трансформацией. Затем учёные могут проводить отбор интересующих бактерий с помощью отбора антибиотиками и другими методами анализа ДНК, чтобы выявить те бактерии, которые содержат нужную плазмиду.

Этапы трансформации бактерий и их отбор

Вот обычная процедура трансформации и отбора бактерий.
  1. Специально подготовленные бактерии смешиваются с ДНК (например, полученной в результате лигирования).
  2. Бактерии подвергаются тепловому шоку, который «побуждает» их захватить плазмиду. Большинство бактерий не захватывают плазмиды, но некоторые всё же это делают.
  3. Плазмиды, используемые при клонировании, содержат ген устойчивости к антибиотику. После трансформации все бактерии помещаются в чашку с питательной средой, содержащей антибиотик и в результате остаются только те бактерии, которые поглотили плазмиду.
  4. Бактерии без плазмиды погибают. Каждая бактерия с плазмидой даёт начало группе идентичных бактерий, содержащих плазмиду, эту группу называют колонией. Типичная колония выглядит как небольшая белая точка размером с булавочную головку.
  5. Несколько колоний проверяются для определения колонии с нужной плазмидой.
  6. Колония, содержащая нужную плазмиду, наращивается в больших объёмах и используется для производства плазмиды или белка.
  1. Специально подготовленные бактерии смешиваются с ДНК (например, полученной в результате лигирования).
  2. Бактерии подвергаются тепловому шоку, в результате чего некоторые из них поглощают плазмиду.
  3. Плазмиды, используемые при клонировании, содержат ген устойчивости к антибиотику. После трансформации все бактерии помещаются в чашку с питательной средой, содержащей антибиотик и в результате остаются только те бактерии, которые поглотили плазмиду.
Схема плазмиды. Плазмида содержит ген устойчивости к антибиотику, промотор, управляющий экспрессией генов в бактериях, и целевой ген, вставленный в процессе лигирования.
  1. Бактерии без плазмиды погибают. Каждая бактерия с плазмидой даёт начало группе идентичных бактерий, содержащих плазмиду, такую группу называют колонией.
  2. Для определения колонии с «правильной» плазмидой проводится проверка нескольких колоний (например, с помощью ПЦР или рестрикционного анализа).
  3. Колония, содержащая нужную плазмиду, наращивается в больших объёмах и используется для производства плазмиды или белка.

Зачем нужно проверять колонии?

Все бактерии, образующие колонии, должны содержать плазмиду, которая обеспечивает ей устойчивость к антибиотикам. Однако вовсе не обязательно, что во всех колониях плазмида будет одинаковой.
Почему так? Когда мы разрезаем плазмиду и вставляем ДНК, часто кроме плазмиды, которую мы собираемся создать, образуются нежелательные продукты. Например, когда мы пытаемся встроить ген в плазмиду с помощью определённой рестриктазы, в некоторых случаях плазмида закрывается обратно (не принимая ген), в других случаях ген встраивается в обратном направлении.
Слева: ген встроился в плазмиду в правильном направлении (направлен в ту же сторону, что и промотор). Именно такого варианта плазмиды после лигирования мы и хотим добиться.
В центре: плазмида закрывается обратно, не встраивая ген. Это бесполезная плазмида.
Справа: ген встраивается в плазмиду в обратном направлении (направлен в противоположную сторону относительно промотора). Если мы хотим в дальнейшем добиться экспрессии гена в бактериях, такая плазмида нам не поможет.
Почему важно, чтобы ген встроился в плазмиду в определённом направлении? В некоторых случаях это неважно. Однако если мы хотим добиться экспрессии гена в бактериях для синтеза белка, ген должен встроиться в плазмиду в правильном направлении относительно промотора или какой-либо другой последовательности, которая управляет экспрессией гена. Если ген будет «перевёрнут», то будет транскрибирована «неправильная» цепь ДНК, и дальнейшего синтеза белка не последует.
Из-за таких нежелательных исходов важно взять плазмидную ДНК из каждой колонии и проверить, соответствует ли она плазмиде, которую мы пытались создать. Для анализа плазмидной ДНК, взятой из бактериальных колоний, обычно используются рестрикционный анализ, ПЦР и секвенирование ДНК.

Синтез белка в бактериях

Предположим, что мы находим колонию с «хорошей» плазмидой. Что происходит дальше? Зачем мы занимались преобразованиями, отбором и анализом?

Вариант 1: Бактерии = плазмидные фабрики

В некоторых случаях бактерии просто используются как «плазмидные фабрики», производящие большое количество плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК можно использовать на следующих этапах клонирования ДНК (например, для создания более сложных плазмид) или в различных экспериментах.
В некоторых случаях плазмиды напрямую используются в практических целях. Например, плазмиды недавно были использованы в клиническом исследовании генной терапии для доставки человеческого гена в ткани легких у пациентов с генетическим заболеванием кистозный фиброз 1.

Вариант 2: Бактерии = белковые фабрики

В других случаях бактерии могут использоваться как «фабрики» по производству белка. Если плазмида имеет правильную последовательность, бактерии можно заставить экспрессировать содержащийся в ней ген после воздействия на них определенного химического сигнала. Экспрессия гена приводит к созданию мРНК, которая транслируется в белок. Затем бактерии можно лизировать (разрушить), чтобы высвободить белок.
Выбранная колония вырастает в большую культуру. В ней бактерии подвергаются стимулированию, чтобы вызвать экспрессию целевого гена, добавлением химического вещества в питательную среду. Внутри каждой бактерии целевой ген транскрибируется в мРНК, а мРНК транслируется в белок. Белок, кодируемый целевым геном, накапливается внутри бактерий.
Бактерии содержат множество белков и макромолекул. Из-за этого новый белок необходимо очистить (отделить от других белков и макромолекул), прежде чем использовать. Для очистки белка есть множество различных методов.
Клетки, которые синтезировали белок, разрушаются (лизируются), высвобождая наружу сам белок и прочее содержимое клетки. Молекулы, извлечённые из клеток, переносятся в колонку, содержащую антитела, специфичные для целевого белка. Таким образом, белок задерживается в колонке, в то время как другие молекулы проходят через неё. На последнем этапе после того, как все не нужные нам белки были смыты, целевой белок высвобождается из колонки, и уже в чистом виде собирается для дальнейшего использования.
Один из таких методов называется аффинной хроматографией. Согласно этому методу смесь молекул, экстрагированных из лизированных бактерий, пропускается через колонку или цилиндр, заполненный шариками. Гранулы покрыты антителом, белком иммунной системы, который связывается с определённой молекулой-мишенью.
Антитела в цилиндре предназначены для связывания с интересующим нас белком, но не с любыми другими молекулами из смеси. Таким образом, интересующий белок задерживается в колонке, а другие молекулы вымываются из неё. На последнем этапе нужный нам белок высвобождается из колонки и собирается для использования.

Дополнительные материалы, помимо материалов Академии Хана

Хотите узнать больше о трансформации бактерий? Посмотрите эту симуляцию от LabXchange.
Хотите узнать больше о селекции трансформированных бактерий? Посмотрите эту симуляцию от LabXchange.
LabXchange - это бесплатная научно-образовательная онлайн-платформа, созданная на факультете искусств и наук Гарварда при поддержке Фонда Амгена.

Хотите присоединиться к обсуждению?

Пока нет ни одной записи.
Знаете английский? Нажмите здесь, чтобы увидеть обсуждение, которое происходит на английской версии сайта.