Основное содержание

Course: Биология > Модуль 17

Урок 2: Клонирование ДНК

Введение в клонирование ДНК

Определение, цель и основные этапы клонирования ДНК.

Основные моменты:

Клонирование ДНК — в молекулярной биологии это один из способов создания множества идентичных копий фрагмента ДНК, например, какого-то гена.
В классическом эксперименте по клонированию целевой ген встраивается в кольцевую молекулу ДНК, которую называют плазмидой.
Плазмида вводится в бактерии посредством процесса, называемого трансформацией. Бактерии, несущие плазмиду, отбираются с помощью антибиотиков.
Бактерии с правильной плазмидой используются для производства большего количества плазмидной ДНК или, в некоторых случаях, для экспрессии гена и наработки белка.

Введение

Когда вы слышите слово «клонирование», возможно, в этот момент вам представляется клонирование целых организмов, таких, как овечка Долли. Однако слово клонировать означает лишь создание генетически точной копии чего-либо. В лаборатории молекулярной биологии чаще всего клонируют ген или какой-то небольшой фрагмент ДНК.

Если ваша знакомая, молекулярный биолог, говорит, что у нее не получается «клонирование», она почти наверняка имеет в виду копирование фрагментов ДНК, а не создание очередной Долли!

Клонирование ДНК — обзор

Клонирование ДНК — это процесс создания нескольких идентичных копий определенного фрагмента ДНК. В типичной процедуре клонирования ДНК ген или другой интересующий нас фрагмент ДНК (возможно, ген какого-то белка, важного с медицинской точки зрения) сначала встраивается в кольцевую молекулу ДНК, называемую плазмидой. Встраивание выполняется при помощи ферментов, которые «вырезают и вставляют» ДНК, в результате чего образуется молекула рекомбинантной ДНК или ДНК, собранной из фрагментов, полученных из нескольких разных источников.

Затем рекомбинантную плазмиду вводят в бактерии. Бактерии, несущие плазмиду, отбираются и выращиваются. В процессе работы они реплицируют плазмиду и передают ее своему потомству, таким образом воспроизводя большое количество копий ДНК.

В чем смысл создания множества копий ДНК плазмиды? В некоторых случаях нам это нужно для проведения экспериментов или создания новых плазмид. В других случаях фрагмент ДНК кодирует полезный белок, и бактерии используются как «фабрики» для производства этого белка. Например, ген человеческого инсулина экспрессируется в кишечную палочку для выработки инсулина, используемого диабетиками.

Как вы, возможно, знаете (если у вас есть друзья или родные, страдающие диабетом), гормон инсулин играет важную роль в здоровье человека. В организме здорового человека инсулин вырабатывается поджелудочной железой. Он проходит через кровоток и поступает в клетки организма, позволяя им усваивать сахар.

У человека с диабетом I типа клетки поджелудочной железы, вырабатывающие инсулин, повреждаются или разрушаются. Такие люди должны регулярно вводить себе инсулин извне, чтобы предотвратить опасно высокий уровень сахара в крови (и позволить сахару проникать в клетки в качестве топлива).

В течение многих лет весь инсулин, который использовался для лечения людей, страдающих диабетом I типа, получали из поджелудочной железы свиней и коров, которых забивали на мясо. Молекула инсулина у людей, свиней и коров идентична, поэтому свиной или коровий инсулин в организме пациента, страдающего диабетом I типа, может заменять человеческий.

Однако, начиная с 1980-х годов, ученые разработали новый подход для производства человеческого инсулина с использованием бактерий Escherichia coli (кишечной палочки). По сути, они превратили бактерии в крошечные «фабрики» по производству инсулина. Этот рекомбинантный инсулин, или инсулин, полученный путем объединения ДНК из нескольких источников (людей и бактерий), в настоящее время является основой для лечения диабета.

Этапы клонирования ДНК

Клонирование ДНК используется для многих целей. В качестве примера давайте посмотрим, как клонирование ДНК можно использовать для синтеза белка (например, человеческого инсулина) в бактериях. Основные шаги этого процесса следующие:

«Разрезание» плазмиды и «вставка» в нее целевого гена. Этот процесс основан на рестриктазах (которые разрезают ДНК) и ДНК-лигазе (которая сшивает ДНК).
Перенос плазмиды в бактерии. При помощи антибиотиков выявляются бактерии, которые содержат плазмиду.
Наращивание большого количества бактерий, несущих плазмиды, и использование их в качестве «фабрик» для производства белка. Получение белка и его очистка.

Рассмотрим подробнее каждый шаг.

1. Разрезание и вставка ДНК

Как можно соединить фрагменты ДНК из разных источников? Обычно используются два типа ферментов: рестриктаза и ДНК-лигаза.

Рестриктаза — это фермент, разрезающий ДНК. Он распознает конкретную последовательность-мишень и разрезает ДНК в этом месте (сайте) или рядом с ним. Многие рестриктазы образуют концы с короткими одноцепочечными выступами. Если две молекулы имеют совпадающие выступы, они могут соединяться за счет комплементарных нуклеотидов. Однако они не смогут связаться, чтобы сформировать непрерывную молекулу ДНК, пока к ним не присоединится ДНК-лигаза, которая свяжет их в единую молекулу ДНК.

Цель клонирования — вставить нужный нам ген (например, ген человеческого инсулина) в плазмиду. Используя тщательно подобранную рестриктазу, мы получим:

плазмиду с единственным сайтом рестрикции;
и фрагмент целевого гена, у которого есть сайты рестрикции на каждом конце.

Затем мы объединяем фрагменты с ДНК-лигазой, которая связывает их, чтобы создать рекомбинантную плазмиду, несущую нужный нам ген.

2. Трансформация бактерий и селекция

Плазмиды и другая ДНК могут быть введены в бактерии, например, в такую безвредную бактерию как кишечная палочка. Она используется в лабораториях на этапе трансформации. Во время трансформации специально подготовленные бактериальные клетки подвергаются так называемому шоку (например, сильному нагреванию), который побуждает их поглощать чужеродную ДНК.

Отличный вопрос! Как ни странно, этого никто точно не знает, хотя трансформация тепловым шоком — очень распространенный метод в молекулярной биологии. Считается, что тепловой шок изменяет текучесть мембраны и/или вызывает образование пор (дыр), что упрощает проникновение ДНК в клетку

^{1}

Плазмида обычно содержит ген устойчивости к антибиотикам, который позволяет бактериям выживать в питательной среде, содержащей определенный антибиотик. Таким образом, бактерии, которые захватили плазмиду, могут быть отобраны на чашках со специальной питательной средой, содержащей антибиотик. Бактерии без плазмиды умрут, а бактерии, несущие плазмиду, будут жить и размножаться. Каждая выжившая бактерия формирует в процессе деления небольшую точечную группу — колонию идентичных бактерий, несущих одну и ту же плазмиду.

Не все колонии будут обязательно содержать правильную плазмиду: во время лигирования фрагменты ДНК не всегда встраиваются в точности так, как мы предполагаем. Поэтому мы должны собрать ДНК из нескольких колоний и посмотреть, содержит ли каждая из них нужную нам плазмиду. Для проверки плазмид обычно используются такие методы как рестрикционный анализ и ПЦР.

3. Наработка белка

Как только мы нашли колонию бактерий с нужной плазмидой, мы можем вырастить из нее большую бактериальную культуру. После чего можно подать бактериям химический сигнал, чтобы они начали производить нужный нам белок.

Бактерии служат миниатюрными «фабриками», создающими большое количество белка. Например, если бы наша плазмида содержала ген человеческого инсулина, бактерии начали бы транскрибировать ген и транслировать мРНК для производства большого количества молекул соответствующего белка.

Люди и бактерии имеют схожий генетический код, а это означает, что человеческий ген может транскрибироваться и транслироваться в бактериях.

Однако для того, чтобы ген человека экспрессировался в бактериях, он должен иметь одну важную модификацию. В частности, в нем не должно быть интронов. Интроны представляют собой промежуточные последовательности, обнаруженные во многих генах человека. Они удаляются из транскриптов эукариотической РНК путем сплайсинга,чтобы получить зрелую мРНК. Бактерии не имеют интронов и не могут изменять транскрипты РНК.

Как мы можем получить человеческого версию гена без интронов? Безынтронная версия человеческого гена может быть получена из мРНК, кодирующей ген, с помощью фермента обратной транскриптазы. Обратная транскриптаза синтезирует цепь ДНК, используя цепь мРНК в качестве матрицы. Для получения двухцепочечной ДНК в результате следующего этапа синтезируется кДНК: из первичного транскрипта удаляются интроны.

После того как белок создан, бактериальные клетки расщепляются, чтобы высвободить его. Помимо целевого белка (например, инсулина) в бактериях есть множество других белков и макромолекул. По этой причине целевой белок должен быть очищен, или отделен от остального содержимого клеток с помощью биохимических методов. Очищенный белок можно использовать для экспериментов или, как в случае с инсулином, вводить пациентам.

И да, и нет. Рекомбинантный инсулин, производимый фармацевтическими компаниями, фактически нарабатывается бактериями, в которых происходит экспрессия модифицированного гена человеческого инсулина, встроенного в плазмиду. Инсулин, производимый бактериями, очищается с помощью колонок.

Однако получение биологически активного инсулина требует дополнительных действий. Инсулин состоит из одной полипептидной цепи. Внутри цепи должны образовываться дисульфидные связи, часть цепи должна отщепиться, чтобы сформировать две отдельные цепи, удерживаемые вместе только дисульфидными связями. Только после этого инсулин становится биологически активным, то есть может действовать как гормон в организме пациента.

Производство инсулина, который может использоваться диабетиками, требует, чтобы эти дополнительные этапы были включены в процедуру очистки белка, чтобы молекула инсулина приняла правильную трехмерную форму.

Практическое использование клонирования ДНК

Молекулы ДНК, созданные с помощью клонирования, используются в молекулярной биологии для различных целей. Вот лишь несколько примеров:

Биофармацевтические препараты. Клонирование ДНК может использоваться для получения белков человека, имеющих биомедицинское применение, например, как упомянутый выше инсулин. Другие примеры рекомбинантных белков включают гормон роста человека, который назначают пациентам, организм которых не может синтезировать гормон самостоятельно, и тканевый активатор плазминогена (tPA), который используется для лечения инсультов и предотвращения образования тромбов. Подобные рекомбинантные белки часто синтезируются с помощью бактерий.
Генная терапия. При некоторых генетических нарушениях у пациентов отсутствует функциональная форма определенного гена. Генная терапия может предоставить нормальную копию гена клеткам организма пациента. Например, клонирование ДНК было использовано для создания плазмид, содержащих нормальную версию гена, не работающего при муковисцидозе. Когда плазмиды были доставлены в легкие пациентов с муковисцидозом, функция легких ухудшалась медленнее $^{2}$ ‍.
Генетический анализ. В научных исследовательских лабораториях биологи часто используют клонирование ДНК для создания искусственных рекомбинантных версий генов, которые помогают им понять, как функционируют нормальные гены в организме.
Например, исследователи, изучающие нейроны у плодовых мушек, могут использовать клонирование ДНК для сборки специальной репортерной конструкции нейронального гена. В этой конструкции регуляторная область (промотор) гена может быть вставлена перед геном, кодирующим флуоресцентный белок. При переносе в муху «репортерный ген» будет экспрессироваться в тех же нейронах, где и сам нейрональный ген, заставляя эти нейроны светиться (флуоресцировать) под воздействием ультрафиолета.

Это всего лишь несколько примеров того, как клонирование ДНК в настоящее время используется в самых разных направлениях молекулярной биологии.

Дополнительные материалы, помимо материалов Академии Хана

Хотите узнать больше о рестриктазах? Посмотрите этот интерактивный материал и симуляцию от LabXchange.

Хотите узнать больше о роли ДНК-лигазы в клонировании генов?Посмотрите этот интерактивный материал и симуляцию от LabXchange.

Хотите узнать больше о трансформации бактерий? Посмотрите эту симуляцию от LabXchange.

Хотите узнать больше о селекции трансформированных бактерий? Посмотрите эту симуляцию от LabXchange.

LabXchange - это бесплатная научно-образовательная онлайн-платформа, созданная на факультете искусств и наук Гарварда при поддержке Фонда Амгена.

Статья опубликована под лицензией CC BY-NC-SA 4,0

Использованные материалы:

Superbest. (2014, June 11). How does heat shock transformation work? In Biology stack exchange. Retrieved from http://biology.stackexchange.com/questions/19038/how-does-heat-shock-transformation-work.
Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Дополнительные ссылки:

Affibody. (n.d.). Insulin capture from human serum. Retrieved from http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.

Amgen Biotech Experience. (2015). Student guide. Retrieved from https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.

Biotechnology. (2016, March 23). Retrieved March 29, 2016 from Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Biotechnology.

Gebel, E. (2013). Making insulin: A behind-the-scenes look at producing a lifesaving medication. In Diabetes forecast. Retrieved from http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https://www.google.com/.

Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (2015, July 3). In NHS choices. Retrieved from http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.

R&D Systems. (2016). Recombinant human growth hormone (GH) protein. In Growth hormone. Retrieved from https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Retrieved from http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Хотите присоединиться к обсуждению?

Войти

Сортировать по:

Пока нет ни одной записи.

Знаете английский? Нажмите здесь, чтобы увидеть обсуждение, которое происходит на английской версии сайта.