Основное содержание
Рестриктазы и ДНК-лигаза
Рестрикционная активность. Липкие концы и тупые концы молекул ДНК. Реакции лигирования.
Основные моменты:
- Рестриктазы
- это ферменты, разрезающие ДНК. Каждый фермент распознает одну или несколько целевых последовательностей и разрезает ДНК в местах этих последовательностей или рядом с ними.
- Многие рестриктазы вносят разрывы в виде ступенек, образуя концы с одноцепочечными выступами ДНК. Однако бывает, что некоторые концы получаются тупыми и выступов не имеют.
- ДНК-лигаза
- это фермент, образующий связь в ДНК после разрыва. Если два фрагмента ДНК имеют совпадающие концы, лигаза связывает их, чтобы сформировать единую, непрерывную молекулу ДНК.
- Рестриктазы и ДНК-лигаза используются при клонировании ДНК для вставки генов и других фрагментов ДНК в плазмиды.
Как вырезать и вставить ДНК?
При клонировании ДНК учёные создают множество копий какого-то фрагмента ДНК, например, гена. В большинстве случаев клонирование включает в себя вставку гена в кольцевую молекулу ДНК, называемую плазмидой, которая может копироваться в бактериях.
Как можно соединить фрагменты ДНК из разных источников (таких как человеческий ген и бактериальная плазмида) в единую молекулу ДНК? Один из распространенных методов основан на использовании рестриктаз и ДНК-лигазы.
- Рестриктаза
- это фермент, разрезающий ДНК, который распознает определенные сайты, по которым вносит разрыв. Многие рестриктазы вносят ступенчатые разрывы по своим сайтам или рядом с ними, образуя концы с одноцепочечными выступами.
- Если две молекулы ДНК имеют совпадающие концы, они могут быть соединены ферментом ДНК-лигазой. ДНК-лигаза соединяет разрыв между молекулами, образуя единый фрагмент ДНК.
Рестриктазы и ДНК-лигаза используются при клонировании ДНК для вставки генов и других фрагментов ДНК в плазмиды.
Рестриктазы
Рестриктазы обнаружены у бактерий и других прокариот. Они распознают и связываются с определенными последовательностями ДНК, называемыми сайтами рестрикции. Каждая рестриктаза распознает только один или несколько сайтов рестрикции. Когда она находит свою последовательность-мишень, то делает двухцепочечный разрыв в молекуле ДНК. Как правило, разрыв находится в сайте рестрикции или рядом с ним. Данный процесс достаточно предсказуем и точен.
В качестве примера того, как рестриктаза распознает и разрезает последовательность ДНК, давайте рассмотрим широко известную рестриктазу EcoRI, используемую в лабораториях. Eco RI вносит разрыв в сайте:
Когда EcoRI распознает этот сайт и вносит разрыв, она всегда делает это по очень специфичной схеме, которая приводит к образованию концов с одноцепочечными «выступами» ДНК:
Если другой фрагмент ДНК имеет такие же выступы (например, потому, что он также был разрезан EcoRI), выступы могут соединяться посредством комплементарного спаривания оснований. По этой причине считается, что ферменты, оставляющие одноцепочечные выступы, образуют липкие концы . Липкие концы полезны при клонировании, потому что они скрепляют два фрагмента ДНК и могут быть объединены с помощью ДНК-лигазы.
Не все рестриктазы образуют липкие концы. Некоторые из них образуют тупые концы, внося разрыв прямо посередине целевой последовательности и не оставляя выступов. Рестриктаза* Sma*I является тем примером, когда образуются тупые концы:
Фрагменты с тупыми концами могут быть соединены друг с другом с помощью ДНК-лигазы. Однако фрагменты с тупыми концами сложнее связать вместе (процесс лигирования менее эффективен и с большей вероятностью потерпит неудачу), потому что нет одноцепочечных выступов, удерживающих молекулы ДНК в нужном положении.
ДНК-лигаза
Если вы знаете о репликации ДНК, то, возможно, вы уже встречались с ДНК-лигазой. В процессе репликации ДНК задача лигазы состоит в том, чтобы соединить вместе фрагменты вновь синтезированной ДНК и сформировать целостную цепь. Лигазы, используемые при клонировании ДНК, в основном делают то же самое. Если у двух частей ДНК совпадают концы, ДНК-лигаза может соединить их вместе, чтобы образовать непрерывную молекулу.
Как ДНК-лигаза это делает? Используя АТФ в качестве источника энергии, лигаза катализирует реакцию, в которой фосфатная группа, выступающая на 5’ конце одной цепи ДНК, связывается с гидроксильной группой, выступающей на 3’ конце другой цепи. В результате этой реакции образуется целостный сахарно-фосфатный остов.
Пример: создание рекомбинантной плазмиды
Давайте посмотрим, как обработка рестриктазами и лигирование можно использовать для вставки гена в плазмиду. Предположим, у нас есть целевой ген, фланкированный сайтами рестрикции EcoRI, и плазмида, содержащая единственный сайт рестрикции EcoRI:
Наша цель - использовать рестриктазу EcoRI для вставки гена в плазмиду. Сначала мы отдельно обрабатываем фрагмент гена и плазмиду EcoRI. На этом этапе получаются фрагменты с липкими концами:
Затем мы берем фрагмент гена, а также линеаризованную (раскрытую) плазмиду и объединяем их вместе с ДНК-лигазой. Липкие концы двух фрагментов слипаются за счет комплементарных пар оснований:
Как только они соединяются с помощью лигазы, фрагменты становятся единым целым неразрывной ДНК. Целевой ген теперь встроен в плазмиду, образуя при этом рекомбинантную плазмиду.
Происходит обработка рестриктазой и лигирование большого количества молекул ДНК
В приведенном выше примере мы видели результат лигирования гена и плазмиды, разрезанных с помощью EcoRI. Однако при таком же лигировании возможны и другие результаты. Например, разрезанная плазмида может рециркуляризоваться (закрываться) без вставки гена. Точно так же ген мог встроиться в плазмиду, а потом вернуться в первоначальное состояние (поскольку два его липких конца EcoRI идентичны).
Обработка рестриктазой и лигирование, подобные этому, проводятся с использованием большого количества копий плазмиды и ДНК, несущий нужный ген. Фактически, миллиарды молекул ДНК используются для осуществления одной реакции лигирования! Все эти молекулы случайно сталкиваются друг с другом и с ДНК-лигазой по-разному. Итак, если есть вероятность образования нескольких продуктов, то все они будут сформированы с определенной периодичностью, включая те варианты, которые нам не нужны.
Как избежать «плохих» плазмид? Когда мы проводим трансформацию бактерий после лигирования, каждая из бактериальных клеток захватывает какой-то вариант получившейся плазмиды. Мы можем проверить бактерии после трансформации и использовать только те, в которых есть правильная плазмида. Часто плазмиду после трансформации бактерий подвергают рестрикционному анализу, чтобы увидеть, содержит ли она нужную вставку в правильной ориентации.
Дополнительные материалы, помимо материалов Академии Хана
Хотите узнать больше о рестриктазах? Посмотрите этот интерактивный материал и симуляцию от LabXchange.
Хотите узнать больше о ДНК-лигазе? Посмотрите этот интерактивный материал и симуляцию от LabXchange.
LabXchange - это бесплатная научно-образовательная онлайн-платформа, созданная на факультете искусств и наук Гарварда при поддержке Фонда Амгена.
Хотите присоединиться к обсуждению?
Пока нет ни одной записи.