Основное содержание
Course: Биология > Модуль 17
Урок 3: Методы анализа ДНКНуклеотидные последовательности ДНК
Как определяется последовательность нуклеотидных оснований (A, T, C и G) в фрагменте ДНК.
Основные моменты:
- Секвенирование ДНК — это процесс определения последовательности нуклеотидов (A, T, C и G) в фрагменте ДНК.
- В секвенировании по Сэнгеру целевая ДНК копируется много раз, образуя фрагменты разной длины. Флуоресцентные нуклеотиды — «терминаторы цепи» — маркируют концы фрагментов и позволяют задать нужную последовательность.
- Секвенирование нового поколения — это новый масштабный подход, который увеличивает скорость и снижает стоимость секвенирования ДНК.
Что такое секвенирование?
Возможно, вы слышали о секвенировании геномов. Например, геном человека был секвенирован в 2003 году после совместного многолетнего труда учёных из разных стран. Но что значит — «секвенировать» геном или небольшой фрагмент ДНК?
Секвенирование ДНК — это процесс определения последовательности нуклеотидных оснований (A, T, C и G) в фрагменте ДНК. Сегодня, при наличии подходящего оборудования и материалов, секвенировать короткий фрагмент ДНК относительно просто.
Секвенирование всего генома (всей ДНК организма) до сих пор остаётся сложной задачей. Для этого требуется разбить ДНК генома на множество более мелких частей, затем секвенировать их и собрать последовательности в единый длинный «консенсус». Однако благодаря новым методам, разработанным в последние два десятилетия, секвенирование генома теперь происходит намного быстрее и дешевле, чем это было во времена проекта «Геном человека»
В этой статье мы рассмотрим методы, используемые для секвенирования ДНК. И сосредоточимся на одном хорошо зарекомендовавшем себя методе — секвенировании по Сэнгеру, а также обсудим методы «нового поколения», благодаря которым учёным удалось уменьшить стоимость и увеличить скорость крупномасштабного секвенирования.
Секвенирование по Сэнгеру: метод обрыва цепи
Участки ДНК длиной до
В проекте «Геном человека» секвенирование по Сэнгеру использовалось для определения последовательностей многих относительно небольших фрагментов ДНК человека (эти фрагменты не обязательно имели длину
Хотя в настоящее время геномы обычно секвенируются с использованием других более быстрых и дешевых методов, секвенирование по Сэнгеру по-прежнему широко применяется для секвенирования отдельных фрагментов ДНК, используемых при клонировании ДНК или созданных с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Реагенты для секвенирования по Сэнгеру
При секвенировании по Сэнгеру создаётся множество копий целевой области ДНК. Его компоненты аналогичны тем, которые необходимы для репликации ДНК в организме или для полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая копирует ДНК in vitro. Перечень компонентов:
- Фермент ДНК-полимераза
- Праймер — короткий фрагмент одноцепочечной ДНК, который связывается с матричной ДНК и действует как «стартер» для полимеразы.
- Четыре нуклеотида ДНК (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
- ДНК-матрица для секвенирования
Однако для реакции секвенирования по Сэнгеру также требуется уникальный реагент:
- Дидезоксинуклеотиды, или терминаторы, версии всех четырех нуклеотидов (дdATP, дdTTP, дdCTP, ддГТФ), каждый из которых отмечен отдельным цветом.
Дидезоксинуклеотиды похожи на обычные дезоксинуклеотиды, но с одним ключевым отличием: у них отсутствует гидроксильная группа на 3’-углероде сахара. В обычном нуклеотиде 3’-гидроксильная группа действует как «крючок», который позволяет добавлять новый нуклеотид к существующей цепи.
После того, как дидезоксинуклеотид добавляется к цепи, гидроксил становится недоступным, и новые нуклеотиды перестают добавляться. Цепь заканчивается дидезоксинуклеотидом, отмеченным определённым цветом красителя в зависимости от основания (A, T, C или G), которое он несёт.
Метод секвенирования по Сэнгеру
Образец ДНК, который необходимо секвенировать, объединяется в пробирке с праймером, ДНК-полимеразой и нуклеотидами ДНК (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). Также добавляются четыре отмеченные красителем дидезоксинуклеотида, обрывающие цепь, но в гораздо меньших количествах, чем обычные нуклеотиды.
Смесь сначала нагревают для денатурации ДНК-матрицы (разделения цепей), затем охлаждают, чтобы праймер мог связаться с одноцепочечной матрицей. После связывания праймера температура снова повышается, позволяя ДНК-полимеразе синтезировать новую ДНК, начиная с праймера. ДНК-полимераза будет продолжать добавлять нуклеотиды в цепь до тех пор, пока вместо нуклеотида не встретится дидезоксинуклеотид. С этого момента новые нуклеотиды не получится добавить, поэтому цепь закончится дидезоксинуклеотидом.
Такой процесс повторяется несколько раз. В конце концов дидезоксинуклеотид практически гарантированно окажется включённым в каждое отдельное положение целевой ДНК, в результате как минимум одной реакции. То есть, в пробирке окажутся фрагменты разной длины, заканчивающиеся в каждой нуклеотидной позиции исходной ДНК (см. рисунок ниже). Концы фрагментов будут отмечены красителями, указывающими на их конечный нуклеотид.
После завершения реакции фрагменты пропускают через длинную тонкую трубку, содержащую гелевую матрицу (этот процесс называется капиллярный гель-электрофорез). Короткие фрагменты проходят через поры геля быстро, а длинные — медленно. Когда каждый фрагмент пересекает «финишную черту» на конце трубки, он освещается лазером, позволяя увидеть прикреплённый краситель.
Первым «финишную черту» пересекает самый маленький фрагмент (заканчивающийся только одним нуклеотидом после праймера), за ним пойдёт фрагмент чуть крупнее (заканчивающийся двумя нуклеотидами после праймера), и так далее. Таким образом, из последовательности цветов красителей, регистрируемых на детекторе, легко построить последовательность исходного фрагмента ДНК. Детектор регистрирует данные в виде серии пиков интенсивности флуоресценции, как показано на хроматограмме выше. Последовательность ДНК соответственно считывается по пикам на хроматограмме.
Использование и ограничения
Секвенирование по Сэнгеру дает высококачественную последовательность для относительно длинных участков ДНК (примерно до 900 пар оснований). Обычно оно используется для секвенирования отдельных фрагментов ДНК, таких как бактериальные плазмиды или ДНК, полученные в результате ПЦР.
Однако секвенирование по Сэнгеру дорого и неэффективно для крупномасштабных проектов, таких как секвенирование всего генома или метагенома («коллективный геном» микробного сообщества). Для таких задач быстрее и дешевле использовать современные методы секвенирования.
Секвенирование нового поколения
Название звучит в стиле «Звёздного пути», но оно действительно так называется! Самые современные методы, предназначенные для секвенирования ДНК, носят название секвенирование нового поколения.
Существует множество методов секвенирования нового поколения, в которых используются разные технологии. Однако большинство из них характеризуется общими свойствами, отличающими их от секвенирования по Сэнгеру.
- Параллельное: одновременно происходит множество реакций секвенирования.
- Микромасштаб: материал настолько крошечный, что его большой объем может быть проанализирован одновременно на поверхности одного чипа
- Быстрый: поскольку реакции выполняются параллельно, результаты будут готовы намного быстрее
- Низкая стоимость: секвенирование генома дешевле, чем секвенирование по Сэнгеру
- Более короткая длина: обычно считываются участки от
Вообще говоря, секвенирование следующего поколения похоже на параллельное выполнение очень большого количества крошечных реакций секвенирования Сэнгера. Благодаря такому распараллеливанию и небольшому масштабу большие объёмы ДНК с помощью методов следующего поколения можно секвенировать намного быстрее и дешевле, чем секвенированием по Сэнгеру. Например, в 2001 году стоимость секвенирования генома человека составляла почти
Зачем нужно быстрое и недорогое секвенирование? Возможность систематического секвенирования геномов открывает новые возможности для биологических исследований и биомедицины. Например, низкозатратное секвенирование — это шаг к персонализированной медицине, то есть к лечению, адаптированному к данному конкретному человеку на основе генов в его или её геноме.
Хотите присоединиться к обсуждению?
Пока нет ни одной записи.