If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Если вы используете веб-фильтр, пожалуйста, убедитесь, что домены *.kastatic.org и *.kasandbox.org разблокированы.

Основное содержание

Электрофорез в полиакриламидном геле

Метод, используемый для разделения фрагментов ДНК и других макромолекул по длине и заряду.

Основные моменты:

  • Гель-электрофорез — это метод разделения фрагментов ДНК по размеру.
  • Образцы ДНК помещаются в лунки (углубления) на одном конце геля, затем через гель пропускается электрический ток.
  • Фрагменты ДНК заряжены отрицательно, поэтому они движутся к положительному электроду. Поскольку все фрагменты ДНК имеют одинаковое количество заряда на массу, поэтому маленькие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем большие.
  • Когда гель окрашивают ДНК-связывающим красителем, фрагменты ДНК выглядят как полосы, каждая из которых представляет собой группу фрагментов ДНК одинакового размера.

Введение

Предположим, вы только что провели ПЦР, получив множество копий целевого фрагмента ДНК. Или, возможно, вы клонировали ДНК, пытаясь встроить ген в кольцевую плазмиду ДНК.
Теперь вы хотите проверить, сработала ли ваша ПЦР и есть ли в вашей плазмиде нужный ген. Какой метод вы можете использовать для визуализации фрагментов ДНК?

Гель-электрофорез

Гель-электрофорез — это метод, используемый для разделения фрагментов ДНК (или других макромолекул, например, РНК или белков) в зависимости от их размера и заряда. Электрофорез — это процесс пропускание тока через гель, содержащий интересующие нас молекулы. В зависимости от своего размера и заряда молекулы будут двигаться в геле в разных направлениях или с разной скоростью, при этом отделяясь друг от друга.
Все молекулы ДНК имеют одинаковое количество заряда на массу. Из-за этого процесс разделения фрагментов ДНК при гель-электрофорезе происходит исключительно по их размеру. При помощи электрофореза мы можем увидеть, сколько различных фрагментов ДНК присутствует в образце и их размеры относительно друг друга. Мы также можем определить абсолютный размер фрагмента ДНК, сравнивая его со стандартным маркером, состоящим из фрагментов ДНК известной нам длины.

Что такое гель?

Как следует из названия, при гель-электрофорезе используется гель — пластина из желеобразного материала. Гели для разделения ДНК часто изготавливаются из полисахарида, называемого агарозой, который в обычном виде представляет собой сухие порошкообразные хлопья. Если нагреть агарозу в буферном растворе (в воде с некоторым количеством солей) и дать ей остыть, тогда образуется затвердевший, но слегка мягкий гель. На молекулярном уровне гель представляет собой матрицу из молекул агарозы, которые удерживаются вместе водородными связями с образованием крошечных поры.
На одном конце формы с гелем создаются небольшие углубления, называемые лунками, в которые затем и помещаются образцы ДНК:
Перед тем как добавить образцы ДНК гель необходимо поместить в специальную ванночку для геля. К одному концу ванночки присоединяется положительный электрод, а к другому концу — отрицательный. Основная часть ванночки, куда помещается гель, заполнена буферным раствором, содержащим соль и проводящим ток. Хотя этого, возможно, и не видно на иллюстрации выше (спасибо моему потрясающему умению рисовать), но буферный раствор заполняет форму с гелем до уровня, при котором он едва покрывает гель
Конец геля с лунками направлен в сторону отрицательного электрода. Конец без лунок (к которому будут перемещаться фрагменты ДНК) расположен возле положительного электрода.

Как фрагменты ДНК движутся в геле?

Как только гель оказывается в ванночке, каждый из образцов ДНК, который мы хотим исследовать (например, продукты, полученные в ходе ПЦР, или продукты, полученные в ходе рестрикционного анализа плазмиды), осторожно переносится в одну из лунок. Одна лунка резервируется для ДНК-маркера — эталона, содержащего фрагменты ДНК заранее известной длины. Коммерческие маркеры ДНК бывают разных размеров, поэтому нам нужно выбрать такой, который хорошо соответствует тому диапазону размеров, который мы ожидаем.
Затем мы включаем питание, и через гель начинает идти ток. Молекулы ДНК заряжены отрицательно из-за фосфатных групп, в сахарно-фосфатном остове, поэтому они начинают двигаться через толщу геля к положительному заряду. Когда питание включено и через гель проходит ток, говорят, что гель бежит.
Образцы ДНК помещаются в лунки со стороны отрицательного электрода.
Включается питание, и фрагменты ДНК перемещаются сквозь гель к положительному электроду.
После этого фрагменты ДНК оказываются разделёнными по размеру. Самые большие фрагменты находятся в верхней части геля (возле отрицательного электрода, откуда они начали своё движение), а самые маленькие фрагменты — в нижней части (возле положительного электрода).
Основано на аналогичной схеме Reece et al.2
В этот момент более короткие фрагменты ДНК будут двигаться сквозь гель быстрее, чем длинные. Спустя некоторое время самые короткие фрагменты ДНК окажутся ближе к положительному электроду, а самые длинные фрагменты ДНК останутся возле лунок. Очень короткие кусочки ДНК могут даже вовсе вырваться из геля, если оставить ток включенным надолго (что, признаюсь, у меня случалось).

Визуализация фрагментов ДНК

После того, как фрагменты разделены, мы можем исследовать гель и посмотреть, какого размера полосы в нём оказались. Когда гель окрашивают ДНК-связывающим красителем и помещают в ультрафиолетовое излучение, фрагменты ДНК начинают светиться, показывая нам группы молекул ДНК по всей длине геля.
Подпись «п. н.» рядом с каждым числом в маркере указывает, из скольки пар нуклеотидных оснований состоит фрагмент ДНК.
Чётко выраженная «линия» ДНК в геле называется полосой. Каждая полоса состоит из большого количества фрагментов ДНК одинакового размера, которые все вместе переместились в одно и то же место. При этом мы не сможем увидеть отдельные фрагменты ДНК (или даже небольшую группу фрагментов ДНК).
Сравнивая полосы в образце с ДНК-маркером, мы можем определить их приблизительный размер. Например, яркая полоса в изображённом выше геле соответствует фрагментам длиной примерно 700 пар нуклеотидов (п. н.).

Проверь себя

Крайняя левая полоса: маркер с отмеченными на нем полосами «3000 п. н.», «1500 п. н.» и «500 п. н.».
Дорожка 1: полоса «5000 п. н.»
Дорожка 2: полоса «100 п. н.»
Дорожка 3: полоса «1500 п. н.» и «2000 п. н.»
Дорожка 4: полоса «500 п. н.»
Сверху на геле пронумерованы четыре дорожки (дорожка — это коридор, по которому движется ДНК, покидая лунку).
Какая полоса какому описанию соответствует?
1
2
3
4
Эта полоса содержит самый длинный фрагмент ДНК.
Эта полоса содержит самый короткий фрагмент ДНК.
Эта полоса содержит фрагмент ДНК длиной 1500 пар оснований (п. н.).

Дополнительные материалы, помимо материалов Академии Хана

Хотите узнать больше об электрофорезе в геле? Посмотрите вот этот интерактивный материал и вот эту симуляцию от LabXchange.
LabXchange - это бесплатная научно-образовательная онлайн-платформа, созданная на факультете искусств и наук Гарварда при поддержке Фонда Амгена.

Хотите присоединиться к обсуждению?

Пока нет ни одной записи.
Знаете английский? Нажмите здесь, чтобы увидеть обсуждение, которое происходит на английской версии сайта.