Если Вы читаете это сообщение, то это значит, что у нас есть проблемы с загрузкой внешних ресурсов для нашего веб сайта.

If you're behind a web filter, please make sure that the domains *.kastatic.org and *.kasandbox.org are unblocked.

Основное содержание

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод, используемый для амплификации или создания множества копий определенной целевого фрагмента ДНК.

Основные моменты:

  • Полимеразная цепная реакция или ПЦР — это метод создания множества копий определенного участка ДНК in vitro (в пробирке, а не в организме).
  • ПЦР основывается на термостабильной ДНК-полимеразе — Taq-полимеразе — и требует ДНК-праймеров , разработанных специально для интересующей нас области ДНК.
  • Процесс ПЦР основан на многократном повторяющемся изменении температуры, что позволяет получить множество копий целевого фрагмента.
  • ПЦР имеет множество применений как в исследовательской деятельности, так и на практике. Она обычно используется при клонировании ДНК, в медицинской диагностике и судебно-медицинском анализе.

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это распространенный лабораторный метод, используемый для создания множества копий (миллионов или миллиардов!) определенного участка ДНК. Копировать можно любой интересующий нас фрагмент. Например, это может быть ген, функцию которого нужно узнать учёному, или генетический маркер, используемый судебными экспертами для сопоставления найденной на месте преступления ДНК с ДНК подозреваемых.
Обычно целью ПЦР является получение такого количества целевого фрагмента ДНК, которое можно было проанализировать или исследовать каким-либо другим способом. Например, ДНК, амплифицированная с помощью ПЦР, может быть отправлена на секвенирование, визуализирована электрофорезом в геле или клонирована в плазмиду для дальнейших экспериментов.
ПЦР используется в биологии и медицине, в том числе в исследованиях в области молекулярной биологии, медицинской диагностики и даже в некоторых областях экологии.

Taq-Полимераза

Как и для репликации ДНК в организме, для ПЦР требуется фермент ДНК-полимераза, который создает новые цепи ДНК, используя существующие цепи в качестве матриц. ДНК-полимераза, обычно используемая в ПЦР, называется Taq полимераза в честь термостабильной бактерии, из которой она была выделена (Thermus aquaticus).
T. aquaticus обитает в горячих гидротермальных источниках. Ее ДНК-полимераза очень устойчива к повышенным температурам и наиболее активна при температуре около 70°C (температура, при которой ДНК-полимераза человека или кишечной палочки перестают функционировать). Эта термостойкость делает Taq-полимеразу идеальной для ПЦР. Как мы увидим позже, высокая температура неоднократно используется в ПЦР для денатурации ДНК-матрицы или для разделения ее цепей.

Праймеры для ПЦР

Как и другие ДНК-полимеразы, Taq-полимераза может синтезировать ДНК только в том случае, если у нее есть праймер — короткая последовательность нуклеотидов, являющаяся отправной точкой для синтеза ДНК. В реакции ПЦР экспериментатор определяет участок ДНК, который будет копироваться, или амплифицироваться, подбирая соответствующие праймеры.
Праймеры для ПЦР — это короткие фрагменты одноцепочечной ДНК, обычно около 20 нуклеотидов в длину. В каждой реакции ПЦР используются два праймера, и они сконструированы так, чтобы фланкировать целевой участок (который необходимо скопировать). Таким образом, праймеры представляют собой последовательности, которые связываются с цепями матричной ДНК точно по краям копируемой области. Праймеры связываются с матрицей, образуя пары комплементарных оснований.
Когда праймеры окажутся связаны с матрицей, полимераза их удлинит, и область, ограниченная ими, начнёт копироваться.

Этапы ПЦР

Ключевыми составляющими реакции ПЦР являются: Taq-полимераза, праймеры, матричная ДНК и нуклеотиды («строительные блоки» ДНК). Компоненты объединяются в пробирке вместе с дополнительными веществами, необходимыми ферменту, и подвергаются повторяющимся циклам нагревания, а также охлаждения, что позволяет синтезировать ДНК.
Основные этапы:
  1. Денатурация (96°C): Сильный нагрев реакционной смеси, чтобы разделить или подвергнуть денатурации цепи ДНК. Этот процесс приведет к образованию одноцепочечной матрицы для выполнения следующего этапа.
  2. Отжиг (55 - 65°C). Охлаждение реакционной смеси, чтобы праймеры могли связаться со своими комплементарными последовательностями на одноцепочечной ДНК-матрице.
  3. Элонгация (72°C): Повторное увеличение температуры реакционной смеси, чтобы Taq-полимераза достроила праймеры, синтезируя новые цепи ДНК.
Такой цикл в стандартной реакции ПЦР повторяется 2535 раз и обычно занимает 24 часа, в зависимости от длины копируемого участка ДНК. Если реакция эффективна (протекает хорошо), то вместо одной или нескольких копий требуемого фрагмента получаются несколько миллиардов.
Это происходит потому, что каждый раз в качестве матрицы используется не только исходная ДНК. Вместо этого новая ДНК, полученная в результате одного цикла, может служить матрицей в следующем цикле синтеза. В реакцию поступает много копий праймеров и множество молекул Taq-полимеразы, поэтому количество молекул ДНК в каждом цикле может удваиваться. Эта модель экспоненциального роста показана на рисунке ниже.

Использование электрофореза в геле для визуализации результатов ПЦР

Результаты реакции ПЦР обычно хорошо заметны благодаря электрофорезу в геле. Электрофорез в полиакриламидном геле — это метод, при котором фрагменты ДНК проходят через гель под действием электрического тока и разделяются по размеру. Дополнительно используется ДНК-маркер, чтобы определить размер фрагментов в образце.
Фрагменты ДНК одинаковой длины образуют «полосу» в геле, которую можно увидеть невооруженным глазом, если гель окрашен ДНК-связывающим красителем. Например, когда в результате ПЦР образуется фрагмент в 400 пар нуклеотидных оснований (п. н.), на геле он будет выглядеть следующим образом:
В каждой полосе ДНК содержится очень много копий целевого фрагмента, а не одна или несколько. Поскольку ДНК имеет микроскопические размеры, чтобы увидеть ее невооруженным глазом, требуется очень много копий. Поэтому ПЦР очень важна: она приводит к образованию достаточного количества копий фрагмента ДНК, чтобы мы могли его увидеть и использовать в дальнейшей работе.

Применение ПЦР

С помощью ПЦР последовательность ДНК можно копировать миллионы или миллиарды раз, создавая достаточное количество копий ДНК для анализа с использованием других методов. Например, ДНК можно визуализировать с помощью гель-электрофореза, отправить на секвенирование или обработать рестриктазами и клонировать в плазмиду.
ПЦР используется во многих исследовательских лабораториях, а также имеет практическое применение в судебной медицине, генетическом тестировании и диагностике. Например, ПЦР используется для амплификации генов, связанных с генетическими нарушениями, при анализе ДНК пациента (или ДНК плода в случае пренатального тестирования). ПЦР также может использоваться для проверки наличия бактерий или ДНК-вирусов в организме пациента: если патоген присутствует, можно амплифицировать участки его ДНК из образца крови или ткани.

Пример: ПЦР в криминалистике

Представьте, что вы работаете в лаборатории судебной экспертизы. И только что получили образец ДНК из волоса, оставленного на месте преступления, а также образцы ДНК трех возможных подозреваемых. Ваша задача — изучить конкретный генетический маркер и проверить, соответствует ли этому маркеру какой-либо из трех подозреваемых.
Маркер бывает двух аллелей, или вариантов. В одном из вариантов содержится один повтор (коричневая область ниже), а в другом — две копии повтора. В реакции ПЦР с праймерами, фланкирующими данную область, первый аллель дает фрагмент ДНК 200 п. н., а второй — фрагмент ДНК 300 п. н.:
Вы проводите ПЦР для четырех образцов ДНК и визуализируете результаты с помощью электрофореза в геле, как показано ниже:
ДНК какого подозреваемого совпадает с ДНК, полученного с места преступления?
Выберите 1 ответ:

Подробнее о ПЦР и криминалистике

При проведении настоящей судебно-медицинской экспертизы ДНК с места преступления специалисты проводят анализ, концептуально аналогичный тому, который показан в приведенном выше примере. Однако при анализе ДНК с мест преступления и ДНК подозреваемых будет сравниваться целый ряд различных генов (а не только один, как в представленном примере).
Кроме того, гены, исследуемые при проведении судебно-медицинской экспертизы, бывают не только двух разных аллелей. На самом деле, они очень полиморфны (поли означает «много», морф — «форма»). То есть, они имеют множество аллелей, которые различаются крошечными изменениями длины фрагмента.
В судебной медицине наиболее часто используются для анализа маркеры, называемые короткими тандемными повторами (микросателлитами, также часто встречается английская аббревиатура STR), которые состоят из множества повторяющихся фрагментов одной и той же короткой нуклеотидной последовательности (обычно от 2 до 5 нуклеотидов). У одного аллеля микросателлита может быть 20 повторов, у другого — 18, а у третьего - всего 101.
Изучая несколько маркеров, каждый из которых имеет множество аллелей, криминалисты могут построить уникальный генетический «отпечаток пальца» из образца ДНК. В типичном STR-анализе с использованием 13 маркеров вероятность ложного срабатывания (возникновения ситуации, когда у двух людей были одинаковые «отпечатки» ДНК) составляет менее 1 на 10млрд1!
Хотя в нашем представлении доказательства на основе ДНК используются в первую очередь для поимки преступников, на самом деле они играют решающую роль в реабилитации ложно обвиненных людей (включая тех, кого надолго посадили в тюрьму). Судебно-медицинский анализ также используется для установления отцовства и идентификации человеческих останков с мест катастроф.

Хотите присоединиться к обсуждению?

Пока нет ни одной записи.
Знаете английский? Нажмите здесь, чтобы увидеть обсуждение, которое происходит на английской версии сайта.