If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Если вы используете веб-фильтр, пожалуйста, убедитесь, что домены *.kastatic.org и *.kasandbox.org разблокированы.

Основное содержание

Способ репликации ДНК: эксперимент Мезельсона-Сталя

Ключевой исторический эксперимент, который продемонстрировал полуконсервативный механизм репликации ДНК.

Основные моменты:

  • Существуют три модели того, как организмы могут реплицировать свою ДНК: полуконсервативная, консервативная и дисперсионная.
  • Полуконсервативная модель, в которой каждая нить ДНК служит шаблоном для создания новой, комплементарной нити.
  • Модели были проверены Мезельсоном и Сталем, которые метили ДНК бактерий разных поколений изотопами азота.
  • Исходя из радиоактивной разметки новой ДНК, которую они увидели, Мезельсон и Сталь подтвердили, что ДНК реплицируется полуконсервативно.

Способ репликации ДНК

Представьте себя в 1953 году, после того, как была обнаружена структура ДНК с двойной спиральюstart superscript, 1, end superscript. Какие вопросы могли возникнуть у вас и у других ученых?
Одним из таких вопросов был связан с репликацией ДНК. Структура двойной спирали ДНК подсказала механизм копирования start superscript, 1, comma, 2, end superscript. Казалось возможным то, что две взаимодополняющие нити спирали могут разделяться во время репликации, каждая из которых служит шаблоном для построения новой нити.
Но так ли это на самом деле? Осторожно спойлер: ответ - да! В этой статье мы рассмотрим знаменитый эксперимент, иногда называемый «самым красивым экспериментом в биологии» в результате которого определили основной механизм репликации ДНК как полуконсервативный - то есть как приводящий к образованию молекулы ДНК, содержащей одну новую и одну старую нитиcubed.

Три модели репликации ДНК

Существовали три основные модели репликации ДНК, которые были предложены научным сообществом после открытия структуры ДНК. Эти модели показаны на диаграмме ниже:
Схематичное представление моделей репликации ДНК.
  1. Консервативный. В процессе репликации получается одна молекула, полностью состоящая из старой ДНК, и одна молекула, полностью состоящая из новой ДНК.
  2. Полуконсервативный. В процессе репликация создаются две молекулы, каждая из которых содержит одну старую и одну новую цепь ДНК.
  3. Дисперсионный. В процессе репликации образуются две молекулы, в которых каждая нить состоит из фрагментов старой и новой ДНК.
_изображение модифицировано, источник: "Процесс репликации ДНК: Изображение 1," by OpenStax College, Biology (CC BY 3,0)._
  • Полуконсервативная репликация. В этой модели две нити ДНК раскручиваются и отсоединяются друг от друга, далее каждая из них выступает в качестве матрицы для синтеза новой комплементарной нити. В результате чего получаются две молекулы ДНК, каждая из которых содержит одну исходную и одну новую цепи.
  • Консервативная репликация. В этой модели результатом репликации ДНК является одна молекула, содержащая обе исходных цепи ДНК (идентичная исходной молекуле ДНК), и вторая молекула, состоящая из двух новых цепей (которые являются точными копиями цепей исходной молекулы).
  • Дисперсионная репликация. В дисперсионной модели результатом репликации ДНК являются две молекулы ДНК, каждая из которых представляет собой смесь, или «гибрид» родительской и дочерней ДНК. В этой модели каждая отдельная нить подобна лоскутному одеялу и состоит из фрагментов исходной и новой ДНК.
Большинство биологов того времени, вероятно, поставили бы свои деньги на полуконсервативную модель. Эта модель имела большой успех, учитывая структуру двойной спирали ДНК, в которой две цепи ДНК идеально предсказуемо дополняют друг друга (где каждому T (тимину) одной цепи, всегда соответствует A (аденин) другой цепи; и также каждому G (гуанину) одной цепи соответствует C (цитозин) другой цепи и так далее)start superscript, 2, comma, 4, end superscript. Учитывая эти соображения, легко представить, что каждая нить выступает в качестве шаблона для синтеза новой цепи.
Тем не менее, в биологии встречается множество примеров, когда «очевидное» решение оказывается неправильным. (Считает ли кто-нибудь сейчас белок генетическим материалом?). Поэтому требовалось опытным путём определить, какая из моделей лучше описывает репликацию ДНК в клетках.

Мезельсон и Сталь разгадывают головоломку

Мэтт Мезельсон и Франклин Сталь впервые встретились летом 1954 года, через год после того, как Уотсон и Крик опубликовали свою статью о структуре ДНК. Несмотря на то, что оба исследователя работали в разных областях, их объединял интерес к вопросу о репликации ДНК, поэтому вместе они решили определить механизм репликацииstart superscript, 5, end superscript.

Эксперимент Мезельсона и Сталя

Мезельсон и Сталь ставили свои знаменитые эксперименты по репликации ДНК, используя бактерии E. coli в качестве модельной системы.
Они начали с наращивания E. coli на питательной среде, также известной как питательный бульон, содержащей "тяжелый" изотоп азота, start superscript, 15, end superscript, start text, N, end text. (изотоп - это просто вариант химического элемента, который отличается от других вариантов количеством нейтронов в ядре атома.) При выращивании на среде, содержащей «тяжёлый» азот start superscript, 15, end superscript, start text, N, end text, бактерии используют его для синтеза новых молекул, в том числе ДНК.
После многих поколений, выросших на среде с изотопом start superscript, 15, end superscript, start text, N, end text, азотистые основания ДНК бактерий были отмечены тяжелым start superscript, 15, end superscript, start text, N, end text. Затем бактерии были помещены на среду, содержащую «легкий» изотоп start superscript, 14, end superscript, start text, N, end text и позволяли расти на ней еще в течение нескольких поколений. ДНК, синтезированная после переключения, должна была состоять из start superscript, 14, end superscript, start text, N, end text, поскольку это был единственный азот, доступный для её синтеза.
Мезельсон и Сталь знали, с какой частотой делились клетки E. coli , поэтому они могли собирать небольшие образцы каждого поколения бактерий, а затем выделять из них ДНК. После чего они измеряли плотность ДНК (и, косвенно, содержание в ней изотопов start superscript, 15, end superscript, start text, N, end text и start superscript, 14, end superscript, start text, N, end text), используя центрифугирование в градиенте плотности.
Этот метод разделяет молекулы, такие как, например, ДНК, на фракции при помощи вращения их на высоких скоростях в присутствии других молекул, например, хлорида цезия. В результате от верха вращающейся пробирки до её донышка образуется градиент плотности. Центрифугирование в градиенте плотности позволяет обнаруживать очень малые различия в плотности, такие, как, например, между ДНК меченой тяжелым изотопом start superscript, 15, end superscript, start text, N, end text и легким изотопом start superscript, 14, end superscript, start text, N, end text.
Схема пробирки, содержащей CsCl (хлорид цезия) и два типа молекул ДНК: меченных азотом-14 и азотом-15, после высокоскоростного центрифугирования. Плотность среды в пробирке наибольшая снизу и наименьшая сверху благодаря образованию градиента CsCl. ДНК, меченная азотом-14, образует полосу, расположенную относительно близко к верхней части пробирки, а ДНК, меченная азотом-15, образует полосу, расположенную ближе к нижней части пробирки. Положение полос отражает их относительную плотность.
_изображение изменено, источник: "Схема эксперимента Мезельсона и Сталя," автор Mariana Ruiz Villareal (public domain)._

Результаты эксперимента

Анализ молекул ДНК первых четырех поколений E. coli выявил картину расположение фракций, показанную на изображении ниже:
_изображение модифицированно, источник: "Процесс репликации ДНК: Изображение 2," by OpenStax College, Biology (CC BY 3,0). Оригинальная иллюстрация "Схема эксперемента Мезельсона и Сталя," автор Mariana Ruiz Villareal (public domain)._
На основе полученных результатов, какие выводы смогли сделать Мезельсон и Сталь? Давайте пройдемся по первым нескольким поколениям, которые предоставляют основную информацию.

Поколение 0

ДНК, выделенная из клеток в начале эксперимента («поколение 0», прямо перед переходом к среде с изотопом start superscript, 14, end superscript, start text, N, end text), давала одну фракцию после центрифугирования. Этот результат был вполне логичным, поскольку в этот момент ДНК бактерий должна была содержать только тяжелыйstart superscript, 15, end superscript, start text, N, end text.

Поколение 1

ДНК, выделенная из бактерий первого поколения (после одного цикла репликации ДНК), также показывала одну фракцию при центрифугировании. Однако эта фракция располагалась уже выше, что указывало на промежуточную плотность между ДНК с тяжелым изотопом start superscript, 15, end superscript, start text, N, end text и ДНК с легким изотопом start superscript, 14, end superscript, start text, N, end text.
Эта промежуточная фракция стала для Мезельсона и Сталя свидетельством того, что молекулы ДНК, полученные на первом этапе репликации, являются гибридом лёгкой и тяжелой ДНК. В следствие чего этот результат соответствует дисперсионной и полуконсервативной моделям, но не соответствует консервативной модели.
Консервативная модель предсказала бы две отдельные фракции в этом поколении (фракция для тяжелой исходной молекулы ДНК и фракция для легкой новой молекулы ДНК).

Поколение 2

Информация о втором поколении позволила Мезельсону и Сталю определить, какая из оставшихся моделей (полуконсервативная или дисперсионная) была действительно правильной.
После того, как ДНК бактерий второго поколения была центрифугирована, она показала две фракции. Первая фракция находилась в той же позиции, что и промежуточная фракция из первого поколения, а вторая была выше (указывая на то, что ДНК отмечена только легким изотопом start superscript, 14, end superscript, start text, N, end text).
Полученный Мезельсоном и Сталем результат подтвердил, что ДНК копировалась полуконсервативно. Две различные градиентные фракции — гибридной молекулы и лёгкой молекулы — можно ожидать именно при полуконсервативной репликации (как показано на диаграмме ниже). Напротив, при дисперсионной репликации все молекулы должны иметь фрагменты как старой так и новой ДНК, что делает невозможным получение чистых «легких» молекул.
Схема эксперимента Мезельсона и Сталя. Вся ДНК изначально мечена азотом-15. Образец ДНК отбирают до добавления бактерий в среду азота-14, и, когда центрифугируют в градиенте CsCl, ДНК образует единственную полосу в нижней части пробирки (что указывает на то, что ДНК полностью мечена тяжелым азотом-15). Этот вариант отмечен как «поколение 0».
Затем бактерии добавляют в среду с азотом-14 и выращивают в течение четырех поколений. При каждом поколении (для роста которого требуется около 20 минут) отбирают образец ДНК и анализируют через центрифугирование в градиенте CsCl.
  • Поколение 0 (смотри выше). 100% ДНК мечены азотом-15.
  • Поколение 1. 100% ДНК в полосе, в промежуточном положении между полосами азота-14 и азота-15.
  • Поколение 2. 50% ДНК в полосе, находящейся в промежуточном положении между полосами азота-14 и азота-15. И еще 50% ДНК в полосе азота-14.
  • Поколение 3. 25% ДНК в полосе в промежуточном положении между полосами азота-14 и азота-15. И остальные 75% ДНК в полосе азота-14.
  • Поколение 4. Уже только 12% ДНК в полосе в промежуточном положении между полосами азота-14 и азота-15. И 88% ДНК в полосе азота-14.
Правая часть рисунка представляет собой схематичное изображение, иллюстрирующее, как полученные результаты могут быть объяснены полуконсервативной моделью. Исходная двойная спираль полностью мечена азотом-15 (поколение 0). При репликации этой спирали образуются две спирали, каждая из которых содержит одну цепь азота-15 (старая) и одну цепь азота-14 (новая) (поколение 1). При воспроизведении этих двух спиралей образуются четыре спирали, две из которых также являются гибридами, содержащими и азот-15 и азот-14, а две состоят исключительно из азота-14 (поколение 2). При воспроизведении спиралей поколения 2 образуются восемь спиралей, две из которых представляют собой гибриды азот-15/азот-14, а шесть - исключительно из азота-14 (поколение 3). Репликация спиралей поколения 3 дает шестнадцать спиралей ДНК, только две из которых представляют собой гибриды азот-15/азот-14, а четырнадцать содержат исключительно азот-14 (поколение 4).
_изображение модифицированно, источник: "Процесс репликации ДНК: Изображение 2," by OpenStax College, Biology (CC BY 3,0). Оригинальная иллюстрация "Схема эксперемента Мезельсона и Сталя," автор Mariana Ruiz Villareal (public domain)._

Поколения 3 и 4

В полуконсервативной модели ожидается, что каждая гибридная молекула ДНК из второго поколения будет давать одну гибридную молекулу и одну легкую молекулу в третьем поколении, тогда как каждая легкая молекула ДНК будет давать при репликации только легкие молекулы.
Таким образом, в третьем и четвертом поколениях мы ожидаем, что гибридная фракция будет становиться всё более узкой (поскольку тогда она представляет меньшую долю всей ДНК), а вторая фракция будет становиться всё шире (так как она представляет всё большую долю).
Как видно на иллюстрации, Мезельсон и Сталь увидели именно такую картину, подтвердившую полуконсервативную модель репликации.

Вывод

Эксперимент, проведенный Мезельсоном и Сталем, продемонстрировал, что ДНК реплицируется полуконсервативно, а это означает, что каждая цепь в молекуле ДНК служит шаблоном для синтеза новой комплементарной цепи.
Несмотря на то, что Мезельсон и Сталь проводили свои эксперименты на бактериях E. coli, сегодня мы знаем, что полуконсервативная репликация ДНК является универсальным механизмом, общим для всех организмов на планете Земля. Некоторые из ваших клеток прямо сейчас полуконсервативно реплицируют свою ДНК!

Хотите присоединиться к обсуждению?

Пока нет ни одной записи.
Знаете английский? Нажмите здесь, чтобы увидеть обсуждение, которое происходит на английской версии сайта.