Основное содержание

Course: Биология > Модуль 14

Урок 3: Репликация ДНК

Молекулярный механизм репликации ДНК

В этом видео мы расскажем о роли ДНК-полимераз и других ферментов репликации. Также объясним различия между лидирующей и отстающей цепями, и расскажем о фрагментах Оказаки?

Основные моменты:

Полуконсервативный механизм репликации ДНК. Каждая цепь двойной спирали выступает в качестве матрицы для синтеза новой, комплементарной цепи.
Синтез новой ДНК осуществляется ферментами, называемыми ДНК-полимеразами, которые синтезируют ДНК в направлении от 5' к 3' концу. Для работы им необходимы матрица и праймер (затравка)
Во время репликации ДНК одна новая цепь (лидирующая цепь) создается последовательно и непрерывно. Другая ( отстающая цепь) создается маленькими фрагментами.
Для репликации ДНК требуются и другие ферменты, помимо ДНК-полимеразы, а именно ДНК-праймаза, ДНК-хеликаза, ДНК-лигаза и топоизомераза.

Введение

Репликация ДНК, или копирование ДНК клетки, не простая задача! В вашем геноме содержится около

3

миллиардов

пар оснований ДНК, и все они должны быть точно скопированы в процессе деления любой из триллионов клеток вашего организма

^{1}

Основные механизмы репликации ДНК одинаковы для всех организмов. В данной статье мы рассмотрим репликацию ДНК в бактерии E. coli (кишечной палочки) — этот процесс протекает схожим образом у людей и других эукариотов

Давайте рассмотрим белки и ферменты, которые осуществляют репликацию, и увидим, как их совместная работа обеспечивает точную и полную репликацию ДНК.

Основная идея

Полуконсервативный механизм репликации ДНК заключается в том, что каждая цепь двойной спирали ДНК выступает в качестве матрицы для синтеза новой комплементарной цепи.

Этот процесс приводит к тому, что из одной исходной молекулы образуются две «дочерние», причем каждая вновь образованная двойная спираль содержит одну новую и одну старую цепь.

В общих чертах, это все, что нужно для репликации ДНК! Однако самое интересное в этом процессе — это как раз то, как он протекает

Клеткам необходимо копировать свою ДНК очень быстро и с минимальным количеством ошибок (во избежание риска развития рака). Для этого они используют различные ферменты и белки, которые действуют совместно для обеспечения бесперебойной и точной репликации ДНК.

ДНК-полимераза

Одной из ключевых молекул в репликации ДНК является фермент ДНК-полимераза. ДНК-полимеразы отвечают за синтез ДНК: они присоединяют нуклеотиды один за другим к растущей цепи ДНК, включая в неё только те нуклеотиды, которые комплементарны матрице.

Вот некоторые основные особенности ДНК-полимеразы:

Им всегда нужна матрица
Они могут присоединять нуклеотиды только к 3'-концу цепи ДНК
Они не могут начать синтез новой цепи ДНК с нуля, поэтому им необходимо наличие уже существующей цепи и короткого фрагмента , называемого праймером или затравкой.
Они корректируют, то есть проверяют свою работу, удаляя большинство «неправильных» нуклеотидов, которые по ошибке встраиваются в новую цепь.

Для присоединения нуклеотидов к цепи требуется энергия. Источником этой энергии являются сами нуклеотиды, к которым прикреплены три фосфата (подобно молекуле АТФ, несущей энергию). Когда связь между фосфатами разрушается, высвобождаемая энергия используется для образования связи между присоединяющимся нуклеотидом и растущей цепью.

Изменённое изображение "ДНК-полимераза" автор Madeleine Price Ball, public domain

У прокариот, таких как E. coli, есть две основные ДНК-полимеразы, участвующие в репликации ДНК: ДНК-полимераза III (основной фермент, участвующий в синтезе ДНК) и ДНК-полимераза I, играющая вспомогательную роль, которую мы рассмотрим позже.

Начало репликации ДНК

Как ДНК-полимеразы и другие факторы репликации узнают, откуда им начать? Репликация всегда начинается в определенных местах ДНК, так называемых точках начала репликации, которые распознаются по нуклеотидной последовательности.

E. coli, как и большинство бактерий, имеет единственную точку начала репликации на своей хромосоме. Длина этого фрагмента составляет около

245

пар оснований и содержит в основном пары оснований A/T (которые удерживаются вместе меньшим количеством водородных связей, чем пары оснований G/C), что облегчает разделение цепей ДНК.

Специализированные белки распознают этот участок и связываются с ним, разъединяя цепи ДНК. В результате образуются две Y-образные структуры, называемые репликационными вилками, которые вместе образуют так называемый репликационный пузырь. В процессе репликации вилки двигаются в противоположных направлениях.

Схема основана на аналогичной иллюстрации из источника Reece et al. $^{2}$ ‍.

Как на самом деле происходит репликация в репликационных вилках? Хеликаза - первый фермент, прикрепляется к точке начала репликации

^{3}

. Задача Хеликазы - продвигать вилки репликации вперед, «расплетая» ДНК (разрывая водородные связи между азотистыми основаниями).

Специальные белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК, обволакивают отдельные нити ДНК возле репликационной вилки, предотвращая их повторное объединение в двойную спираль.

Праймеры и праймаза

ДНК-полимеразы могут добавлять нуклеотиды только к 3'-концу существующей цепи ДНК. Они используют свободную группу -ОН, находящуюся на 3'-конце, в качестве «крючка», прицепляя новый нуклеотид к этой группе в результате реакции полимеризации. Как же тогда ДНК-полимераза присоединяет первый нуклеотид на новой репликационной вилке?

В одиночку она это сделать не может! Эта проблема решается с помощью фермента праймазы. Праймаза создает РНК праймер или короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный матрице, который формирует 3'-конец для работы ДНК-полимеразы. Типичный праймер имеет длину от пяти до десяти нуклеотидов. Праймер способствует началу синтеза ДНК, то есть даёт ему старт.

Как только РНК-праймер синтезирован, ДНК-полимераза «удлинняет» его, добавляя нуклеотиды один за другим, чтобы получить новую цепь ДНК, которая комплементарна матричной цепи.

Лидирующая и отстающая цепи

У бактерии E. coli, ДНК-полимераза, которая осуществляет большую часть синтеза, является ДНК-полимеразой III. На репликационной вилке находятся две молекулы ДНК-полимеразы III, каждая из которых усердно работает над одной из двух новых цепей ДНК.

Одна новая цепь, которая проходит от 5' к 3'-концу по направлению к вилке репликации, является простой. Эта цепь создается непрерывно, потому что ДНК-полимераза движется в том же направлении, что и вилка репликации. Эта непрерывно синтезируемая цепь называется лидирующей цепью.

В другой новой цепи, которая направлена от репликационной вилки от 5'-конца к 3'-концу, всё немного сложнее. Эта цепь строится фрагментами, потому что по мере движения вилки ДНК-полимераза удаляется от неё, и ей в какой-то момент приходится отрываться и снова присоединяться к новому открывшемуся фрагменту. Эта цепь, достраивающаяся фрагментами, называется отстающей цепью.

Маленькие фрагменты называются фрагментами Оказаки. Они названы в честь японского ученого, который их обнаружил. Лидирующая цепь может быть синтезирована на основании одного праймера, в то время как отстающая цепь нуждается в новом праймере для каждого из коротких фрагментов Оказаки.

Бригада по техническому обслуживанию и уборке

Существуют и другие белки и ферменты, помимо перечисленных выше основных, необходимые для обеспечения бесперебойной репликации ДНК. В частности, это так называемые белки скользящего зажима, которые во время синтеза ДНК удерживают молекулы ДНК-полимеразы III. «Скользящий зажим» — это белок в форме кольца, не дающий ДНК-полимеразе III отсоединиться при переходе к новому фрагменту Оказаки

^{4}

Топоизомераза также играет важную поддерживающую роль в репликации ДНК. Этот фермент предотвращает слишком плотное скручивание двойной спирали ДНК перед вилкой репликации при раскрытии ДНК. Он вносит временные разрывы в спирали, чтобы снять излишнюю спирализацию цепей, а затем восстанавливает их, чтобы избежать необратимых повреждений.

Наконец, после всех этих процессов нужно сделать небольшую уборку, если мы хотим, чтобы в ДНК не оставалось РНК или зазоров. ДНК-полимераза I, ещё одна участвующая в репликации полимераза, удаляет РНК-праймеры и заменяет их на ДНК. Разрывы, которые остаются после удаления праймеров, восстанавливаются ферментом ДНК-лигазой.

Итоги: репликации ДНК у бактерии E. coli

Давайте уменьшим масштаб и посмотрим, как ферменты и белки, участвующие в репликации, работают вместе, чтобы синтезировать новую ДНК.

Хеликаза раскрывает ДНК в репликационной вилке.
Белки, связывающие одноцепочечную ДНК (их также называют SSB-белки), удерживают разделённые цепи ДНК вблизи репликационной вилки, предотвращая их обратное соединение.
Топоизомераза работает перед вилкой репликации и предотвращает чрезмерное скручивание.
Праймаза синтезирует РНК праймеры комплементарные цепи ДНК.
ДНК полимераза III удлинняет праймеры, добавляя нуклеотиды к 3'-концу и создавая основную часть новой ДНК.
РНК праймеры удаляются и заменяются на ДНК с помощью ДНК полимеразы I.
Разрывы между фрагментами ДНК восстанавливаются ДНК лигазой.

Репликация ДНК у эукариот

Основные принципы репликации ДНК схожи как у бактерий, так и у эукариотов (в частности, у людей), но есть и некоторые различия:

Эукариоты обычно имеют несколько линейных хромосом, каждая с несколькими точками начала репликации. У человека может быть до $100 000$ ‍ точек начала репликации $^{5}$ ‍!
У большей части ферментов E. coli есть аналоги в эукариотической системе репликации ДНК, но то, что в кишечной палочке выполняется одним ферментом, у эукариотов может выполняться несколькими ферментами. Например, у человека существует пять различных ДНК-полимераз , каждая из которых игрет важную роль в репликации $^{5}$ ‍.
Большинство хромосом эукариотов — линейны. Из-за особенностей создания отстающих цепей при каждой репликации часть фрагментов ДНК на конце линейных хромосом теряется. Их называют теломерами).

Дополнительные материалы, помимо материалов Академии Хана

Хотите узнать больше о репликации ДНК? Посмотрите этот интерактивный контент от LabXchange.

LabXchange - это бесплатная научно-образовательная онлайн-платформа, созданная на факультете искусств и наук Гарварда при поддержке Фонда Амгена.

Ссылки:

Это изменённый вариант статьи "DNA replication in prokaryotes," OpenStax College, Biology, CC BY 4,0.

Статья опубликована под лицензией CC BY-NC-SA 4,0

Использованные материалы:

National Human Genome Research Institute. (2010, October 30). The human genome project completion: Frequently asked questions. In News release archives 2003. Retrieved from https://www.genome.gov/11006943.
Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Origins of replication in E. coli and eukaryotes. In Campbell biology (10th ed., p. 321). San Francisco, CA: Pearson.
Bell, S. P. and Kaguni, J. M. (2013). Helicase loading at chromosomal origins of replication. Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 5(6), a010124. http://dx.doi.org/10,1101/cshperspect.a010124.
Yao, N. Y. and O'Donnell, M. (2008). Replisome dynamics and use of DNA trombone loops to bypass replication blocks. Mol. Biosyst., 4(11), 1075-1084. http://dx.doi.org/10,1039/b811097b. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4011192/.
OpenStax College, Biology. (2016, May 27). DNA replication in eukaryotes. In OpenStax CNX. Retrieved from http://cnx.org/contents/GFy_h8cu@10,53:2l3nsfJK@5/DNA-Replication-in-Eukaryotes.

Дополнительные материалы:

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., and Stryer, L. (2002). DNA is replicated by polymerases that take instructions from templates. In Biochemistry (5th ed., section 5,3). New York, NY: W. H. Freeman. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22513/

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., and Stryer, L. (2002). DNA polymerases require a template and a primer. In Biochemistry (5th ed., section 27,2). New York, NY: W. H. Freeman. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22374/.

Cooper, G. M. (2000). DNA replication. In The cell: A molecular approach (2nd ed.). Sunderland, MA: Sinauer Associates. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9940/.

Eukaryotic DNA replication. (2016, January 14). Retrieved January 21, 2016 from Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Eukaryotic_DNA_replication.

Garland Science. (2009, April 16). DNA replication [Video file]. In YouTube. Retrieved from https://www.youtube.com/watch?v=-mtLXpgjHL0.

Genetics Society of America. (2014, March 20). Loblolly pine genome is largest ever sequenced: Seven times bigger than the human genome. In ScienceDaily. Retrieved January 20, 2016 from http://www.sciencedaily.com/releases/2014/03/140320100520.htm.

Kresge, N., Simoni, R. D., and Hill, R. L. (2005). Arthur Kornberg's discovery of DNA polymerase I. Journal of Biological Chemistry, 280, e46. Retrieved from http://www.jbc.org/content/280/49/e46.

Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira, P., Baltimore, D., and Darnell, J. (2000). The DNA replication machinery. In Molecular cell biology (4th ed., section 12,2). New York, NY: W. H. Freeman. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21751/.

Loeb, L. A. and Monnat, R. J. (2008). DNA polymerases and human disease. Nature Reviews Genetics, 9, 594-604. http://dx.doi.org/doi:10,1038/nrg2345.

Moran, L. A. (2007, October 31). DNA polymerase I and the synthesis of Okazaki fragments [Web log post]. In Sandwalk: Strolling with a skeptical biochemist. Retrieved from http://sandwalk.blogspot.com/2007/10/dna-polymerase-i-and-synthesis-of.html.

Moran, L. A. (2008, May 9). DNA replication in E. coli: The problem [Web log post]. In Sandwalk: Strolling with a skeptical biochemist. Retrieved from http://sandwalk.blogspot.com/2008/05/dna-replication-in-e-coli-problem.html.

National Human Genome Research Institute. (2010, October 30). The human genome project completion: Frequently asked questions. In News release archives 2003. Retrieved from https://www.genome.gov/11006943.

New England Biolabs. (2016). DNA polymerase proofreading. In PCR, polymerases & amplification technology products. Retrieved from https://www.neb.com/products/pcr-polymerases-and-amplification-technologies/pcr-polymerases-and-amplification-technologies/dna-polymerase-proofreading.

OpenStax College, Biology. (2016, May 27). DNA replication in eukaryotes. In OpenStax CNX. Retrieved from http://cnx.org/contents/GFy_h8cu@10,53:2l3nsfJK@5/DNA-Replication-in-Eukaryotes.

Pandey, M., Syed, S., Donmez, I., Patel, G., Ha, T., and Patel, S. S. (2009). Coordinating DNA replication by means of priming loop and differential synthesis rate. Nature, 462, 940-943. http://dx.doi.org/10,1038/nature08611.

Pray, L. A. (2008). Major molecular events of DNA replication. Nature Education, 1(1), 99. Retrieved from http://www.nature.com/scitable/topicpage/major-molecular-events-of-dna-replication-413.

Purves, W. K., Sadava, D. E., Orians, G. H., and Heller, H.C. (2004). The molecular mechanisms of DNA replication. In Life: The science of biology (7th ed., pp. 222- 227). Sunderland, MA: Sinauer Associates.

Raven, P. H., Johnson, G. B., Mason, K. A., Losos, J. B., and Singer, S. R. (2014). DNA: The genetic material. In Biology (10th ed., AP ed., pp. 256-277). New York, NY: McGraw-Hill.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Many proteins work together in DNA replication and repair. In Campbell biology (10th ed., p. 318-327). San Francisco, CA: Pearson.

Tabancay, A. P. and Forsburg, S. L. (2006). Eukaryotic DNA replication in a chromatin context. Current Topics in Developmental Biology, 76, 129-184. http://dx.doi.org/10,1016/S0070-2153(06)76005-7.

Yao, N. Y. and O'Donnell, M. (2008). Replisome dynamics and use of DNA trombone loops to bypass replication blocks. Mol. Biosyst., 4(11), 1075-1084. http://dx.doi.org/10,1039/b811097b. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4011192/.

Хотите присоединиться к обсуждению?

Войти

Сортировать по:

Пока нет ни одной записи.

Знаете английский? Нажмите здесь, чтобы увидеть обсуждение, которое происходит на английской версии сайта.